背景介绍

多糖在植物、微生物和动物中普遍存在，它们在功能食品和医学领域被寄予厚望。大量研究表明，从自然资源中分离的多糖对生物活性有显著影响，如抗氧化作用、抗炎作用、低血糖作用、神经保护作用和抗肿瘤作用。多糖的化学修饰为其生物性质的改善指明了方向，有时会产生新的功能活性，从而改变其结构和构象性质。此外，与天然多糖相比，多糖的化学修饰可以提高生物活性。多糖修饰，特别是羧甲基化和硫酸化，已经成为功能开发和利用的通用修饰方法。多糖修饰可能与化学性质密切相关，如链构象的变化、取代度的差异和分子量的差异。因此，多糖修饰直接影响活性，这归因于多糖结构的变化。

在以前的研究中，AAP70-1具有(2→6)连接的β-D-呋喃果糖骨架和α(2→1，6)连接的β-D-呋喃果糖侧链，该侧链具有内部α-D-吡喃葡萄糖，已被证明具有显著的神经保护和免疫活性。大量的AAP70-1来自知母的根和产量计算为1.0%。AAP70-1是一种均质多糖，纯度为96.3%，在食品和医药领域具有巨大的发展潜力。然而，天然和修饰的的AAP70-1的抗氧化活性尚未进行研究。

抗氧化剂对人体健康有清除自由基的有益作用，可用于预防疾病和维护饮食补充剂中的健康。作为具有自由基清除功能的抗氧化剂，植物多糖不仅可以预防糖尿病、心血管疾病和阿尔茨海默病中的氧化应激损伤，还可以缓解许多慢性疾病的进展。因此，研究它们的抗氧化活性具有重要意义。

本研究分别采用氯乙酸-异丙醇法和氯磺酸-吡啶法合成了羧甲基化多糖和硫酸化多糖。分析了CMAAP70-1s和S-AAP70-1的理化性质和结构特征。此外，研究了不同取代度的羧甲基化多糖和硫酸化多糖的体外抗氧化活性，并与天然多糖(包括DPPH多糖和羟基自由基清除剂)进行了比较。同时，我们比较了羧甲基化多糖和硫酸化多糖的抗氧化活性。

研究结果

?多糖活性与结构特征密切相关。采用氯乙酸-异丙醇修饰法，包括两步反应，制备了羧甲基化衍生物。首先，在氢氧化钠和羟基的环境下，在AAP70-1上形成醇盐基团。其次，烷氧基和一氯乙酸按照SN2反应。通过改变氯乙酸的含量，制备了三组不同取代度的羧甲基化多糖(CM-AAP70-1s)。

用氯磺酸-吡啶法制备了羟基被硫酸基团取代的硫酸化衍生物(S-AAP70-1)。

2.1CM-AAP70-1s和S-AAP70-1的理化性质和结构参数

结构参数是多糖修饰成功的重要指标，包括分子量和取代度。从羧甲基化和硫酸化两个方面对多糖进行了修饰。CM-AAP70-1s各单体的凝胶渗透色谱（HPGPC）均出现一个明显的单峰，表明在修饰过程中获得了均一的多糖。多角度激光散射显示AAP70-1的分子量为2.72×g/mol，羧甲基改性后的CM-AAP70-1-A、CM-AAP70-1-B和CM-AAP70-1-C的分子量分别为4.50×、5.27×和8.65×g/mol。各种修饰后的多糖的分子量均大于天然多糖，进一步证明多糖的修饰是成功的。这结果还表明，氯乙酸的比例与取代度和分子量呈显著正相关。

对于硫酸化多糖(S-AAP70-1)，产率高于AAP70-1。分子量为9.76×g/mol的S-AAP70-1有一个单一的尖锐峰，用高功率凝胶渗透色谱和多角度激光检测。这一结果间接说明了多糖链的完整性和衍生化的成功。在硫酸修饰过程中，由于单糖上的羟基被硫酸基团取代，S-AAP70-1的分子量增加。羧甲基化和硫酸化衍生物分子量的增加证明多糖修饰是成功的。

2.2紫外-可见光谱

紫外是检测样品中蛋白质和核酸存在的重要工具。CM-AAP70-1s的紫外光谱在nm和nm之间没有指示峰(图1)，表明CM-AAP70-1s没有蛋白质或核酸。结果与考马斯亮蓝G-法一致。然而，S-AAP70-1的紫外光谱在nm处有微弱的吸收峰，这可能是由于S-AAP70-1中含有少量吡啶所致(图1)。蛋白质同样没有岀峰，用考马斯亮蓝G-法测定。1HNMR数据显示了吡啶的信号(δH8.45，8.29，7.94ppm)，证实nm处的吸收归因于吡啶而不是蛋白质。?

图1

2.3CM-AAP70-1s和S-AAP70-1的红外光谱

红外光谱可以间接表明多糖修饰是否成功。在红外光谱中鉴定出AAP70-1衍生物的特征吸收峰(图2.A)。就羧甲基化基团引入CM-AAP70-1s而言，多糖的典型信号可以在cm-1、cm-1和cm-1附近观察到，这分别被称为羰基中的C=O不对称拉伸振动、C-O拉伸振动和亚甲基振动。

红外光谱法易于检测硫酸化基团。在S-AAP70-1的光谱中(图2.B)cm-1处的吸收带归因于硫酸基团的硫氧拉伸振动，cm-1处的吸收带归因于碳氧硫拉伸振动。在指纹区域，可以发现cm-1处的信号，这可能对应于硫酸盐基团的碳氧硫的弯曲振动。

图2

2.4刚果红测试分析

刚果红用于测试多糖是否具有三螺旋构型。如果多糖具有三螺旋结构，当多糖和刚果红混合到碱性环境中时，随着碱性增强，多糖-刚果红的最大吸收波长(λmax)将显著降低。如图3所示，修饰前后样品的λmax没有红移，表明修饰和未修饰的多糖都没有三螺旋构象。

图3

2.5扫描电子显微镜分析

扫描电子显微镜可以提供有关样品表面形态和外观的信息。因此，通过扫描电镜技术对羧甲基化和硫酸化多糖的表面形貌变化进行了表征。如图4所示，观察到CM-AAP70-1s的形状已经从原始球体转变为不规则的状态，这可能与羧甲基化的羟基取代的无序有关。多糖表面形态的差异表明，硫酸盐修饰可以改变AAP70-1的表面形态，这可能增加多糖的水溶性并影响其生物活性。

图4

2.6抗氧化活性分析

2.6.1DPPH自由基清除活性

DPPH自由基在室温下是一种稳定的自由基，通常用作评估抗氧化剂清除自由基活性的工具。DPPH是一种确定的以氮为中心的亲脂性自由基，在nm(紫色)乙醇中显示特征吸收。当它被抗氧化剂还原成非自由基形式的DPPH-H时，紫色很快消失。根据该原理，测量了CM-AAP70-1s和AAP70-1对DPPH自由基的清除作用，如图5.A所示。结果表明，修饰的样品的DPPH自由基清除活性明显高于未改性样品。随着样品浓度的增加，样品的清除率逐渐上升。当样品浓度低于0.8mg/mL时，DPPH清除能力排序为：CM-AAP70-1-ACM-AAP70-1-BCM-AAP70-1-CAAP70-1。当样品浓度超过1.6mg/mL时，DPPH清除能力排序为：CM-AAP70-1-CCM-AAP70-1-BCM-AAP70-1-AAAP70-1。AAP70-1、CM-AAP70-1-A、CM-AAP70-1-B和CM-AAP70-1-C的IC50分别为6.2、1.9、1.5和1.0mg/mL。CM-AAP70-1s清除活性的不同可能是由于取代度的不同。S-AAP70-1的DPPH清除作用(图5.B)高于未修饰的样品。结果证明，多糖经过羧甲基化和硫酸化后，增强了其清除DPPH自由基的活性。

2.6.2羟基自由基清除活性

羟基自由基可直接或间接对人体组织造成损伤，因此可能会降低组织功能或引起病变。至于羟基自由基清除活性(图5.C)羧甲基化样品的活性明显高于AAP70-1。不同取代度和分子量的CM-AAP70-1s的抗氧化活性呈上升趋势，但低于相同浓度下的Vc。CM-AAP70-1-A、CM-AAP70-1-B和CM-AAP70-1-C的IC50分别为0.3、0.3和0.4mg/mL。并且具有相似的规律，即取代度和分子量越大的样品清除效果越高，这可能与羧基的引入有关。对于硫酸化的样品，S-AAP70-1的IC50为1.1mg/mL。活性高于未修饰的，但低于可能与硫酸化基团的引入有关的Vc(图5.D)。

从羟基自由基的抗氧化能力来看，羧甲基化修饰的清除效果高于硫酸化修饰，这可能与硫酸化基团和羧甲基化基团的根本区别有关。体外活性测定结果表明，CM-AAP70-1s具有较高的抗氧化活性，表明取代基的引入对多糖的活性有显著影响，这可能与CM-AAP70-1的结构变化或分子间/分子内氢键有关。羧甲基化基团的引入显著增加了原始多糖的水溶性，提高了抗氧化活性。

3.研究结论

本研究成功地修饰了一种从知母中分离的果聚糖，获得了不同取代度的羧甲基化和硫酸化衍生物。作者评估了它们的体外抗氧化活性，包括DPPH和羟基自由基。结果表明，与天然抗氧化剂相比，两者的抗氧化活性均有显著提高。特别是分子量和取代度较高的CM-AAP70-1s表现出较强的抗氧化活性。此外，羧甲基化和硫酸化修饰是提高多糖抗氧化活性的有效方法。这些结果进一步表明多糖衍生物的取代官能团、取代度和分子量是影响其生物活性的关键因素。未来，具有抗氧化潜力的羧甲基化和硫酸化多糖可直接作为有价值的抗氧化剂用于药物开发中预防多种疾病。该研究将为提高果聚糖作为潜在抗氧化剂的抗氧化活性提供方向和理论依据。

本文于年7月2日首次发表于杂志InternationalJournalofBiologicalMacromolecules，第一作者是ZhengguoLi，LinanZhou，通讯作者是JingXu，通讯单位是南开大学分子药物研究天津重点实验室药学院药物化学生物学国家重点实验室。

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